在凱達高速冷凍離心機用硫氰酸胍離心法提取RNA

在凱達高速冷凍離心機用硫氰酸胍離心法提取RNA

    用硫氰酸胍法取代酚/氯仿/異戍醇-乙醇法提取RNA，該方法是用高濃度的硫氰酸胍裂解純化的細胞核，它是離液序列高的試劑，解離核酸蛋白質(zhì)復合物，并在破碎過程中使細胞內(nèi)核酸酶快速失活，然后通過稠密的CsCI墊層阻止DNA和蛋白質(zhì)沉降，最后用脲-LiCI純化回收RNA，該法也適合于從細菌、植物、動物組織里抽提RNA。本方法由Glisin等（1974）、Chirgwin等（1979）和Auffrag與Roageon（1980）等人建立和發(fā)展。

a. 把細胞核懸浮在5mol/L硫氰酸觚、5mmol/L  Tris-HCl、50mmol/LEDTA、5%（體積分數(shù)）2-巰基乙醇（PH=7.0）中，細胞核濃度為（1～5）×10⁷個/mL。

b. 通過超聲處理剪切DNA，使其分子量降低。

c. 加固體N-月桂酰（十二酰）肌氨酸鈉到2%（質(zhì)量濃度），當溶解肌氨酸時，把溶液在50℃加熱2min。

d. 給高速離心機水平轉(zhuǎn)子的離心管里加5.7mol/L  CsCl、50mmol/L  EDTA（PH=7.0），再把含RNA溶液鋪放在CsC1墊層上。CsC1墊層的體積是硫氰酸胍溶液的0.25倍。

e. 在15℃高速離心24～48h，RNA形成沉淀，而蛋白質(zhì)和DNA分布在溶液里，如下圖所示。

在5.7mol/L  CsCL上的細胞核（或整細胞）硫氰酸胍裂解物經(jīng)高速水平轉(zhuǎn)子離心后內(nèi)容物分布圖解如下圖所示。

CsC1屏障法分離RNA

f. 用吸管吸出上清液直到DNA帶（可以用透射折射和黏度來判斷），倒出剩余溶液，把離心管顛倒放在棉紙上，使之徹底排于，以減少DNA對RNA的污染。

g. 從離心管底部0.5～1.0cm高度處把離心管切掉（把DNA區(qū)帶占據(jù)的位置切掉），把干凈的凝膠狀RNA沉淀用1~2mL的滅菌水洗出。

h. 加入1/9體積的滅菌3mol/L 乙酸鈉（PH=7.0）、2.5倍體積的乙醇。放置于-20℃過夜使RNA沉淀。

i. 在0℃、最大16000g離心10min收集RNA（凱達KH20R-Ⅱ高速冷凍離心機10000r/min），并重新懸浮在70%（體積分數(shù)）乙醇里洗沉淀，然后用95%乙醇洗（每次使用離心機的離心的條件都是一樣的），再在真空干燥器里或再用干燥氮氣使RNA干燥。

j. 除去殘留在RNA里的微量DNA是把沉淀重新溶解在0.5mL的滅菌水里，與0.5mL 8mol/L脲、4mol/L LiCI（PH=7.0）混合，混合物在4℃過液，通過離心收集RNA沉淀，按步驟i清洗和干燥。

k. 把RNA沉淀重新懸浮在0.3mol/L乙酸鈉（PH=7.0）里，再加2.5倍體積的乙醇-20℃過夜，收集RNA沉淀，按步驟i清洗和干燥。

l. RNA可以脫水儲存于-20℃，或者溶解在滅菌水里，分成小份儲存于-20℃。

至此，完成了使用凱達離心機對RNA的離心分離提取。